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沿阶草组织培养及再生体系的研究

归档日期:12-26       文本归类:沿阶草属      文章编辑:爱尚语录

  Y 938931分类号:密级:飞哦差≮夭等硕士学位论文单位代码:10019学 号:s030402沿阶草组织培养及再生体系的研究Study OH the system oftissue culture andregenerationof Ophiopogon bodinieri研 究 生:衄 拖指 导 教 师:屈 丞申请学位门类级别:盘坐题专 业 名称:堇些科堂研 究 方向:越直堇鲤生缦他所 在 学 院;麴堑型拉堂跪2006年6月 摘 要用沿阶草的根状茎芽点、花蕾、花柄、嫩基、叶片、块根和根尖作为外植体,用MS作为基础培养基,在愈伤诱导、分化和生根过程中添加不同浓度和比例的细胞分裂素(6.BA,KT)和生艮素(NhA,IAA,IBA,2,4.D),培养结果及主要结论如卜:(1)根状茎芽点作为外植体时,向蔗糖浓度3%、pH5.8,0.8%琼脂固化的MS培养基中添加6-BA2-0mg/L+NAA0.2mg/L诱导愈伤组织产生及MS+6.BA2.0mg/L+NA AO.1mg/L和1/2MS+NAA0.tmg/L培养基分别诱导不定芽和根产生的组合培养效果最好。(2)花蕾作为外植体时,向蔗糖浓度2%、pH5.8.0.5%琼脂固化的MS培养基中添加6.BAl.0mg/L+NAA06mg/L诱导愈伤组织产生及MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L和1/2MS+IBA0.型Smg/t.培养基分别诱导不定芽和根产生的组合培养效果最好。(3)花柄作为外植体时产生的可再生材料较根状茎芽点和花蕾量少,所以不建议作为沿阶草的组织培养材料使川。嫩基、叶片、块根和根尖未诱导出愈伤组织。关键词:沿阶草根状茎芽点花蕾组织培养 中国农业大学硕Jj论文AbstractAbstractThe segments from various part of Ophiopogon bodinieri are cultured on MS medium supplement-ed with variable ratio of hormones.The segments forthe trial age bud of rootstock,flower bud,flowerstalk,tender base,rootblock,leaf and root tip.Hormones for minclude bios42,4-D,NAA,lA~IBA)and kinin(6-BA,KT).The ratio and concentration of the bios and cytokinin vary in the course of tissueculture.The results for culture showed as followed:(1)Themediums of MS+6-BA 2.0m鲈^NAA0.2mg/L for inducement,MS+6-BA2.0rag/L+NAA0.1 mg/L for differentiation and I/2MS+NAA0.1mg/L for reotage is best suitable for bud ofrootstock tissue culture.The MS medium is supplied with 3%suclose and O.8%agar at as well as at pH5.8.(2)The mediums of MS+6-BAl.0mg/tA-N从0.6me,,Lfor inducement,MS+6BA2.0mg/L+NAA0.1 mg/L for differentiation and 1/2MS+IBA0.25mg/L for footage is bestsuitable for flower budtissue culture.The MS medium is suppfied with 2%sucrose and 0.58%agar at as well as at pH 5.8.(3)The segments of flower stalk can produce less regenerating material than thatof bud ofrootstock andflower bud,so it is not be suggested as the material for tissue culture.tender base,rootblock,leaf and root tip dont induce the tissueofcalluses.Key words:Ophiopogon bodinieri;Bud of rootstock:Flower bud;Tissue cultureII 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:f厕钓时间:,∥年歹月 //日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名{,_物一名:㈢年铽讯t沁、年 具r黾时间:2。。,年 f月,彳日 中国农业大学硕士论文第一章前苦第一章前言1.1植物组织培养的概念及其原理组织培养是指在无菌条件下,植物的任何器官、组织或细胞培养牲含有营养物质和植物生长凋节等物质的培养基中,使其生K、分化形成完整植株的过程。组织培养的理论依据是植物细胞具有全能性。所谓全能性即任何具有完整的细胞核的植物细胞都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息。植物细胞和动物细胞在生理特性上不完全一样。动物细胞的分化一般是不可逆的。植物细胞则不然,只要具有一个完整的膜系统和一个有生命力的核,即使是已经高度分化成熟羊分化的细胞,也还保持着回复到分生状态的能力。一个成熟细胞转变为分生状态的过程叫做脱分化,然后再经历再分化的过程利用的就是细胞的全能性。植物细胞全能性的实现必须满足两个条件:一是离体培养实现脱分化即细胞要从植物体其余部分的抑制性影响卜解脱出来,二是要给予营养和受到激素作用实现在雨分化。在大多数情况F,再分化过程在是愈伤组织细胞中发生的,但在有些情况F,也有不经过愈伤组织直接分化出芽来的,如烟草的薄层表皮细胞。细胞实现再分化过程有两种不同的方式,一是器官发生,即愈伤组织的部分细胞先分化出芽,雨在另一种培养基上产生根;二是胚状体发生,即愈伤组织产生与种子胚相似的结构,同时形成一个有苗端午I根端的两极性结构。组织条件下,不同种类和培养条件的植物可能走不同发生途径,也可能同时走两种发生途径。1.2组织培养的研究进展1.2.1植物细胞全能性的探索植物组织培养开始于19世纪后半叶,在Schwann和Schleiden发展起米的细胞学说的推动一1.-,1839年Schwann提出细胞有机体的每一个生活细胞在适宜的外部环境条件下都有独立发育的潜能。1853年Trecul利用离体的茎段和根段获得了愈伤组织,但没有再生出完整植株,这还不能证明细胞具有全能性。Habedandt(1902)首次提出了细胞培养的概念,也是第一个用人jI:培养基对分离的植物进行培养的人。但Haberlandt的实验由于培养液过于简单和细胞高度分化而失败。1904年E.Harming在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝h和辣根菜的胚,并使这些胚在离体条件F长到成熟,这是胚培养的最早的实验。1908年S.Simon研究白杨嫩茎在培养中的发育,观察到了愈伤组织的发生和根、芽的形成。Laibach(1925,1929)把由弧麻种间杂交形成的不能成活的种子中的胚剖出,在人工培养基上培养到成熟,从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性。1922年W.Kotte朋稀释的Konp溶液加入相当复杂的有机物质培养豌豆和玉米的根尖,获得了某 中国农业人学碗1:论义 第一章前占些成功,这是有关根培养的最早实验。Haberlandt自1902年的实验后,转而对损伤修复发生兴趣,提出激素作t}{}j的概念,这为后来的激素理论的建立和在组织培养中广泛应用奠定了基础。但自Haberlandt的实验,直到1934年White培养罱茄根尖的成功,期间30多年里,植物组织培养技术儿乎没有什么进展。分析其原因,主要就是培养基的成分单一和实验所选取的材料不够合适。1.2.2植物组织培养技术的发展到了30年代中期,植物组织培养领域里出现了两个重要的发现.其一是,认识了B族维生素对植物生K的重要意义;二是发现了生K素是一种天然的生长调节物质。导致这两个发现的主要是,R.J.Gautheret幂ER.white的实验。1934年White由番茄根建立r第一个活跃生的无性系,使根的离体培养实验首次获得了真止的成功,并首次发现和提出B族维生素B1、维生素B6平烟酸的重要性。与此同时.Gautheret在山毛柳和黑杨等形成层组织培养中发现了B族维生素和生K素吲哚乙酸的作用,并使培养获得了成功。但是,在此之前,组织培养使用的材料都包含了分生组织。诱导成熟平业已分化的细胞发生分裂,则直接到后来发现了细胞分裂素之后才成为可能。Skoog(1944)和崔澄等(1951)发现,腺嘌呤或腺苗不但可以促进愈伤组织的生长,而且还可能解除培养基中生长素(LAA)对芽的抑制作用,诱导芽的形成。1955年Miller等在鲜鱼精子DNA热乐水解产物中,发现了有高度活力的健进细胞分裂和芽形成的物质,并命名为激动素(kinetin)。现在,具有和激动素类似活性的合成的或天然的化台物已有多种,它们总称为细胞分裂素(cytokinin)。应_}}j这类物质,就有可能诱导出已经成熟和高度分化的组织的细胞进行分裂。1957年Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念,指出通过改变培养基中生长素和细胞分裂素的相对浓度可以控制器官的分化:这一比率高时促进生根(杨增海,1987);低时促进茎芽的分化;二者浓度相等时,组织则倾向于以一种无结构的方式生长。后来证明,激素可调控器官发生的概念对丁多数物种都适刚,只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同,因而对于某一具体的形态发生过程来说,它们所要求的外源激素的水平也有所不同。50年代开始的10年中,植物组织培养还取得了儿项引人注目的进展。1952年Morel和Martin首次证实,通过茎尖分生组织的立体培养,可以由已受病毒感染的大丽花中获得无毒植株。1953年wH.Muff发明了细胞悬浮培养技术(suspension culture),对万寿菊和烟草进行单细胞培养获得成功,同年Muir还设计出了看护培养技术(nurse culture)。1958年有两项重要发现:一项是J.Reinert和FC.Steward分别发表了由胡萝h块根髓的愈伤组织制备的单细胞,经悬浮培养产生了人量的胚状体(embryoid)和小植株,这一过程与胡萝h的受精卵形成合子胚的发育极为相似。这就是用实验证明植物细胞的全能性。另一项是M.Wiekson和K.V.Thimann发现采州外源的细胞分裂素,可促使休眠的侧芽启动生长,形成一微型得多枝多芽的小灌木丛状结构,将嫩梢切割,可在短期内重复这一过程,嫩梢也能转入生根培养基上生根,这样可不断复制山人量的小植株。在这一阶段中,通过对培养条件和培养基成分的广泛研究,特别是对B族维生素、生K索和细胞分裂素在组织培养种作用的研究,已经实现了对离体细胞生民和分化的控制,从而初步确立了组纵培养的技术体系。2 中国农业大学硕_:论文 第一章前言1.2.3植物组织培养的应用到了60年代,植物组织培养技术开始与常规育种、良种繁育和遗传一I:程技术相结合,在植物改良中发挥了重要的作用,并且在若干方面已经取得了可观的经济效益。这期间的技术发展主要分为三个方面:(1)原生质培养1960年,E.C.Cocking等人采用真菌纤维素酶、果胶酶等酶制剂分离番茄幼根,获得大量健康的原生质体。1971年I.Takebe等首次由烟草原生质体得到了再生植株,证明了无壁原生质体的同样具有全能型。据统计,到1988年有12种观赏植物的原生质体可以得到再生植株(孙培文等,1993)。原生质体培养的成功,促进了体细胞融合技术的发展。1972年P S.Carlson等通过了粉蓝烟草和郎氏烟草的原生质体融合,获得了第一个体细胞杂种。在这方面,高国楠等建立的通过PEG处理促进细胞融合的方法得到了广泛的麻刚。(2)花药培养1964年s.Guha昶I S.C.Maheshwari在南洋金中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。1967年,Bourgin和Nilsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。由丁单倍体在突变选择加速杂合体纯化过程中的重要作用,这一领域的研究在整个70年代得到了迅速发展,获得成功的物种数目增加到160余种,其中包括很多种栽培植物。烟草、水稻和小麦等花的育种在中国取得了引人注目的成就。(3)微繁技术得到了广泛应用1960年,法国人GMotel发明了“一个用组织培养技术无一眭繁殖兰花的新方法。通过该方法,一个lmm K的兰花摹尖在一年内可以生产上百万个植株,由丁.其繁殖系数极高。有着巨大的实用价值,很快为兰花生产者所接受。其后这一技术导致欧洲、美洲和东南弧许多国家“兰花工业(Odchidindustry)”的兴起,所以“兰花一J:业”对现代花卉的栽培产生了巨大的影响。除兰花外,其他很多观赏植物和经济作物(如甘蔗和草莓等)中,微繁也已达到目的I:厂化的生产规模。1.2.4我国组织培养的研究及应用1933年李继侗等了开展了银杏的胚胎培养,将银杏胚乳的提取物加入培养基,获得成功。这是利用天然提取物获得成功的首次报道。1935~1940年间罗宗洛等做了玉米等植物根尖的离体培养,取得很有意义的成果。1944年罗士韦成功培养了菟丝子的茎尖。1945年ESkoog肃I崔澄发现腺嘌呤能有效的促进细胞分裂,并诱导烟草茎髓愈伤组纵形成芽。我国组织培养研究一直很缓慢,直至20世纪70年代才开始出现新的局面,发展速度加快,在在某些方面尤其是花药和原生质方面,我国学者的1:作已经受到了世界各国同行的普遍重视年u赞赏。农作物、果树、林木、观赏植物、蔬菜、中草药、糖料作物以及草被等植物的组织培养中,无论是。I:厂化生产,还是理论探索阶段都取得了令人瞩目的成绩(罗士韦,1983:许锢宏,1994)。比如马铃薯快速繁殖无病毒种苗这一技术已在我国25个省、市、自治区推广,1988年脱毒马铃 中国农业人学硕士论文 第一章前言薯种植面积达26.5万hm2,产量提高50%。草莓无毒苗比带毒苗增产10%以上(杭玲等,1999)。另外,广东省建立的香蕉无毒苗快繁基地,已生产销售了400万株无毒苗,增产20%~25%,并出口港澳地区和日本。兰花快繁生产线已在甘肃省落成,柑橘、苹果、葡萄等已建立无菌苗种苗基地,开始进行犬规模商品化产业化生产(信乃诠,1999)。在1985年以前,作为粮食和饲料主要来源的禾谷类植物的原生质体培养鲜有突破,只是最近儿年间,水稻、玉米、小麦、高粱和大麦等的原生质体培养才相继告捷。在这方面,我国学者做山了重要贡献。烟草、水稻和小麦等花药育种在中国也取得了引人注目的成就。在利用植物组织培养改良植物生物学特性方面,我国处于世界领先行列。1974年我国育成了世界上第一个作物新品种~单育1号烟草品种(陈发棣,2002)。到目前为止,有24种以上的花粉植株是我国学者首先完成的。比如:利用花药组培育成的中花8号、9号、14号等水稻新品种,推广面积达27万hm2以上;京花1号等小麦新品种,种植面积达6.7万hm2。近50年来,我国采川植物组织培养技术生产次级代谢产物的研究也取得了b速的发展。我国学者已经对400多种植物进行了研究,从培养细胞中分离到600多种次级代谢产物,其中60多种在含量上超过或等于其原植物(崔堂兵,2001)。比如:目前临床所需的紫杉醇主要是从红豆杉植物的树皮种提取到的,其含量仅为树皮干重的0.0l%(张K河,1996;陈永勤,2000)。按照现在的提取jI:艺,每提取1Kg紫杉醇要砍伐1000~2000棵树以剥取足够的外皮。红豆杉资源上的限制和提取I:艺的复杂性,火犬限制了紫杉醇的临床应用,利用人:I:培养的红豆杉细胞来提取紫杉醇,可消除天然提取带米的资源枯竭问题,便丁扩人生产和r业化生产,成为一种可行的替代途径(Bringi等,1995)。此外,为了保护和持续利用珍稀的新疆紫草自然资源,进行r新疆紫草细胞人量培养及生产紫草宁衍生物的研究。目前已经取得了实验室规模的成功,在紫草宁衍生物总含量上己超过国际现有水平,现已进入中试阶段。1.3牧草及草坪草的组织培养研究概况世界上约有75%的牧草和草坪草属于禾本科牧草,而禾本科牧草的组织培养再生相对较难.Chela(1977)进行了禾本科牧草的组织培养工作,当时只是诱导山了愈伤组织。禾本科牧草进行组织培养的难点主要是适用的外植体较单一,如幼穗、花药、幼胚、原生质体、悬浮细胞等。目前已形成再生植株的禾本科牧草和草坪草约有65个种,30个属,其中多数是草坪草(Wang,1994)。Lo等(1980)对冰草(Crested wheatgrass)和偃麦草的幼穗及Park等(1989)对加拿大披碱草(Canadian dahurian)幼胚进行培养均获得了愈伤组织。由于愈伤组织不便开展遗传转化的研究,研究者开始采用胚性细胞的悬浮培养。王增裕等(1994)成功获得了高羊茅(Tall[escue)和多花黑麦草(Italian ryegrass)胚性悬浮细胞;Zaghout(1989)建立利紫羊茅(Redfescue)的胚性细胞悬浮培养体系,筛选出适合悬浮培养的最佳培养基,而且得出了悬浮细胞液在3mm的滤膜中过滤开始分化这个至关重要的结论。悬浮细胞培养获得的植株遗传上不稳定,同时也不便丁进行转基冈方面的研究,这样一来许多已建立悬浮细胞培养体系的草坪草都相继开展了原生质体的悬浮培养小作。王增裕等(1993)通过原生质体培养获得草地羊茅(Meadowyescue)的再生植株。4 中国农业人学硕士论文 第一章前言组织培养技术在牧草育种中已有广泛应用,但主要集中于豆科牧草。如在1998年成功地微体繁殖紫花苜蓿(一扣/fa)杂种。应用胚珠培养获得向三叶(White clover)与库拉三叶草的杂种,将库拉三叶草的抗病毒基网通过种问杂交转移给白三叶(White clover),克服授粉后的不育性,获得远缘杂种(赵桂兰等,1996)。花药培养是获得单倍体的最有效的方法。据报道,已分别获得了紫花苜蓿(一和tfa)、鸭茅(Orchardgrass)等牧草的花粉单倍体植物和苇状羊茅(Tall[escue)叶柄培养物诱导的单倍体植株(赵桂兰等,1996)。在种质保存方面,已成功地进行了紫花苜蓿愈伤组织培养物冰冻保存基生活力和再生力的研究(赵桂兰等,1996)。原生质体能够吸附或摄入外源细胞、脂质体、质粒等,是外源遗传物质的良好受体;又能通过相互融合产生体细胞杂种,克服杂交不亲和性,产生不对称杂种及实现细胞器的融合和重组。因此。高效率地从原生质体再生完整植株是应州于遗传I:程的关键。目前,许多牧草通过原生质体培养获得了再生植株,如多花黑麦草(Westerwold ryegrass)与苇状羊茅(Tall fescue)的原生质体融合:还实现了苜蓿属(Medic)、自咏根属(Lotus)及三叶草属(Trifolium)间原生质体融合;同时鉴定异核体的方法也有突破,如用携带选择标记基因的根癌农杆菌转化亲本的方法选择融合后的异核体,已在卣脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medic)种间融合的异核体筛选中取得较好的效果(浅野义t:人,1993;江玉林等,1993:舒文华等,1994;刘玲珑等,2000:郭振b和卢少云,2002)。1.4植物组织培养的应用及意义1.4.1无性系快速繁殖植物组织培养的快速繁殖,就是应用组织培养和细胞培养技术,快速繁衍珍稀濒危植物,使物种得以保存;以及快速繁殖名优特新品种,使其在一定时间内繁衍为一定数量的植株。快速繁殖的植株能保持母本的生物特性和遗传性状,并可在短期内种植于田间。快速繁殖是当前植物细胞上程中鹿用最广。泛,又最有效的方法之一,在农林园艺药用植物(罗士韦,1978、1988;李文安,1988)、吲艺植物(Mantell和Mckee,1985)方面得到广泛应用。Brown等1986年统计进行快速繁殖研究的植物超过1000种以上。陈维伦1990年统计。我国快速繁殖的植物已达443种,已有100多个机构采用快速繁殖技术进行工厂化大规模商品生产,包括香蕉、甘蔗、核树、花卉苍。1.4.2花药培养和花粉单倍体育种离体花药花粉培养的单倍体育种法,与常规方法相比。可以在短时间pj得到作物的纯系,从而加快育种过程。我国科学家设计的Ns花药培养基和马铃薯培养基。不仅在国内得到推广,也被国外采用。到1987年为止.据不完全统计,我国各地用花药或花粉培育出的植物已有22科52属160个种,取得了较大的成就。已培育出小麦“花培1号”、“京花1号”,水稻“中花1号”等优良品种,并已大面积推广种植。同时花药培养可以进行多倍体的杂交,培养等5 中国农业大学硕.I:论文 第一章前言(Yabuya.T,1991)。1.4,3药用植物的工厂化生产当前各地采用组织培养来加速药用植物(如人参、紫草、贝母、三分三、甘草等)的繁殖生长已获得成功,并投人工厂化生产。我国植物种类繁多,草药的研究和利用具有悠久的历史,但过度采挖使某些药用植物资源遭到严重破坏,因此开展药用植物I:厂化生产是很有必要的。1.4.4种质的保存和基因库的建立种质的保存和基因库的建立在育种工作中是十分重要的。由于组织培养材料的体积小,利于在低温(如低温冰箱)或超低温(如液态氮)中跃期保存。广西林科院林术花卉培养I:厂经过多年的引进与研究,现已建立了品种达50多种的花卉组培基冈库(千以红,2000)。1.4.5突变体的筛选培育在细胞和组织培养进程中,基因型易发生变异,因此人们采用紫外线、x射线、Y射线对培养物照射,或者在培养基中加入叠氮化合物等,以诱导和提高突变频率,产生人们需要的突变体,供人们筛选培育。我国己选筛出耐盐的水稻、烟草、甘蔗的再生植株或细胞系,也筛选出比对照赖氨酸高56-3%的玉米胚性细胞团。1.5沿阶草概述沿阶草属是百国台科草本植物,全世界约有50种,分布于亚洲东部和南部的亚热带和热带地区.我国有33种及3个变种,主要分布在我国西南和东南。经研究,我国沿阶革属植物的地理分布规律及区系特点是:1.特有种多,共有29种(包括变种);2.地理成分复杂,其中以亚热带成分为主,占52.78%;3.该属植物分布在南北方向上变化明显,呈梯度递减;东西向呈递增趋势:4.种内分化缓和,仅有长茎沿阶草、连药沿阶草和沿阶草3种发生了种内的变化(刘享平等,1998)。沿阶草(Ophiopogon bodinieri)是沿阶草属的一种多年生根茎草本植物,根细小而分枝多,在近末端或中部常膨人成为纺锤形肉质小块根;茎短、不分枝、直立,为叶鞘所裹;地F根茎细,匍甸生长;时生成丛状:总状花序顶生,花向色域淡紫色。花被片6,分离,两轮排列,雄蕊6枚,在北京花期是7.10月;种子常一个或多个同时发育,桨果状,球形或椭圆形,早期绿色,成熟后呈暗蓝色,在北京果期810月。沿阶草既能在强阳光照射F生长,又能忍受荫敝环境,属耐荫植物。在建筑物背阴处或竹丛高火乔术的阴影F终年不见直射阳光的地方能茂盛生长,且叶面比直射光F翠绿而且有光泽。林6 中国农业大学硕士论文 第一章前言士埕等(2004)对沿阶草的光强度适应性进行了测定.结果表明,在10001x的弱光下沿阶草植株生氏良好,其叶片时绿素含量随光强度的减弱而增强,叶绿素的a/b比值在弱光下降低缓慢。所以说沿阶草是典型的耐荫植物。除此之外,沿阶草还有较强的其它方面的抗逆性,耐寒性表现在:.200C的低温下安全越冬;耐早性表现在:根系发达,能储存大量的水分和营养物质.叶片具有蜡质保护层,可在干旱环境F最大限度地减少水分蒸发,既干旱月份叶片含水量仍能达到60%一80%(张进友。2003),是Jt方难得的优良抗逆性草坪草种。另外,沿阶草繁殖速度快、容易建植、四季常绿。当然,沿阶草也有它的不足之处,叶色灰绿且较宽,观赏性稍差。1.6沿阶草组织培养的研究进展在我国,沿阶草跃期以来以块根供药_I_fj,其块根含有黄酮、糖、微鼙元素、氨基酸和皂甙等药用成分;具有养阴生津、润肺清心功效,,主治肺燥干咳,律伤口渴等症。冈此,沿阶草的组纵培养研究,I作的最初目的是能够实现快速繁殖。吴美芬(1988)、张治国(1988)和杨乃博(1992)有成功将沿阶草叶片培养成再生植株的报导。同时也有一些与沿阶草植物学关系较近的植物组织培养的报道,林美爱等(2004)报导了山麦冬嫩基增殖培养的成功:莫肖蓉等(2000)报导了金边阔叶山麦冬根状苇芽点和花蕾再生植株培养的成功。1.7本研究的目的和意义草坪业作为一种新兴的产业在我国发展迅速,城市中高大建筑的数量也迅速增加,因此对耐荫草坪草的研究就显得非常重要。目前我国应用的冷季型草坪草大多不耐荫,沿阶草作为北方优良的抗性草坪有很强的耐荫性,四季常绿,叉可以给北方冬天一片枯黄的景色带来一些绿的生机。作为强耐荫植物,沿阶草成为耐荫机理研究和基因筛选的优良材料。当然,沿阶草也有它的不足之处,比如叶色较暗、叶片较宽硬、不柔软等。为了使沿阶草得到更加广泛的应用,改良沿阶草的坪用性状也成为一项重要的任务。组织培养是快速选育优良性状和筛选优良基因的有效途径,也是目前人多数分子育种和转基因工程所需的。为此.我们开展了沿阶草的组培研究。本研究力图找到适合沿阶草组织培养的外植体和培养条件,为筛选耐荫基因和改良其坪用性状建立再生体系的组培基础。7 2.1试验目的第二章试验设计2.1.1寻找沿阶草不同外植体的灭菌条件2.1.2找出沿阶草容易成功培养再生植株的外植体2.1.3找到适合沿阶草组织培养外植体的最佳培养基2.1.4模拟已经成功培养的沿阶草及相近植物山麦冬组织培养试验条件,观察沿阶草在相同外植体和培养基条件下的培养效果2.2试验材料沿阶草(ot,hiol,oeon 60dmieti)取自中国农业大学校内草坪。2.3试验方法2.3.1外植体的选择和处理分别选择沿阶草根状苇芽点、花蕾、花柄、叶片、块根、根尖和嫩基(包含茎尖的根的基部)作为沿阶草组织培养的处植体材料。为了找到合适的消毒时间和浓度,本试验设计了外植体消毒的处理3×3×6=54个,其中70%的酒精消毒时问3个水平(分别是20s,30s,40s);NaCIO,浓度3个水平(分别是O.5%,1.0%,3.5%);NaCl03消毒时间6个水平(分别是15min,20rain,35min,40min,45min,55min)。经过15天的培养观察.从无激素添加的MS基础培养基中选出各种外植体灭菌率为100%的最小消毒浓度和时间的组合。处理方法是从沿阶草植株上切取合适外植体后立即用自来水冲洗干净,再用70%的酒精消毒,然屙用无菌水冲洗一次屙,马上放到净工作台中用不同处理浓度的NaCl0,浸泡,最后无菌水洗涤5次后立即接种到无激素添加的MS基础培养基中进行观察和记录。8 中国农业大学硕士论文第二章试验设计2.3.2培养基的选择2.3.2.1诱导愈伤组织产生的培养基将沿阶草外植体根状茎芽点、花蕾、花柄、叶片、块根、根尖和嫩基分别放到培养基MS+激素组合1(见表1)中进行培养,观察其培养效果。表1诱导沿阶草外檀体愈伤组织的激素组合Table 1 Trcabofhomaoncsforinducement ofcallustissueofsegmentsof印扁!P咿HBoaemknBios concentration 6-BA 6-BA 6-BA 6-BA6-BA i面五(me/L)0.51.0 1.5 2.02.5 3.0注;NAA(Naphlhalcneaceaie acid的缩写):萘己酸;N:NAA的简写;6-BA(6Bcnzyladeniae的缩写):6-苄基脒嗉畸:B:6-BA的简写另将嫩基外植体放到MS+激素的培养基组合2(见表2)中进行培养,观察其培养效果。表2诱导嫩基愈伤组织的激素组合Table 2 Trcats ofhormonesforinducement ofcMlustissue oftender root oloph/opogon bodm面riNAA 0.2x1(N0 2,B2d X2(N0.2,B1nKI o)x3(N0 2,Kl o)NAA 0.5x4(No 5,B2 o) K(№s,B1 o.Kt 0)(No.5,K1 o)IBA 0.5x7005,B2D Xs(Ioj,Bl mKl曲X900,5,Kl_0)B:6-BA的简写;IBA(Lqdole-3一butyric acid):吲哚-3.丁酸:l:毋A的简写。9 中国农业大学硕~I:论文 第二章试验设计另将叫片、块根和根尖外植体放到培养基MS+激素组台3(见表3)中进行培养,观察其培养效果。裹3诱导沿阶草叶片和块根及根尖愈伤组织的麓蠢组台Table3 Trcats of hormones for inducement ofcallus tissue oflOOt block and root卸of Ophiapogon白矗InTreat2,4-DNAA IAA 6一BAYlY2Y3Y4Y52146O.25注:2,4-0(2,4-Dichlmophenoxyacetic的缩写):2,4-二氯苯氧己酸iNAA(Naphthaleneacmic acid的缩写):萘己酸;1AA(1ndolc-3蚓dcacid的缩写):吲哚_3一乙酸: 6-BA(6-Benzyladenlne的缩写):6r苄甚腺嘌峙。通过以上3个组合对外植体的培养,观察其培养效果。并将对外植体培养效果好的培养基进一步细分继续开展第2轮培养,从而找出沿阶草适宜组织培养的外植体的最佳诱导培养基。同时也就同类的不同激素之间的可替代性做上些研究。2.3.2.2分化培养基所有外植体均采用MS+6-BA(6-苄基腺嘌呤)2.Omg/L+NAA(萘乙酸)0.Im#L作为分化培养基。2.3.2.3生根培养基采用1/2MS+NAA(萘乙酸)0.]mg/L*O 1/2MS+IBA(吲哚3-J酸)0.25mg/L对不同外植体进行生根培养,比较两种不同培养基的效果。2.3.3组培苗的移栽生根培养结束后,将组培苗经过2个星期的炼占后移栽至蛭石:草炭土:园土=1:1:1的基质盘中配台适当光照种植培养,观察生长情况。10 中国农业大学硕士论文第一二章试验设计2.3.4培养条件备组合培养基的蔗糖浓度3%、pH5.8、用0.8%琼脂固化,121{2条件F高压灭菌25min。找到能够诱导适合外植体产生不定芽的诱导培养基后,比较蔗糖浓度2%、pH5.8、埘o.5%琼脂吲化的培养基与蔗糖浓度3%、pH5.8、用0.8%琼脂固化的培养基培养的效果。除沿阶草嫩基外植体在愈伤组织诱导阶段采用1000Ix全光谱每天照射12h的培养条什外,其它外植体在此阶段均采用暗培养:所有外植体在分化和生根培养阶段均采用10001x全光谱每天照射12h培养条件a整个培养过程中,培养温度为2512,湿度为85%左右。为防It养分不足和褐化影响,不同阶段培养的培养基均采用25天继代一次。2.3+5硝酸银(AgN03)处理植物进行组织培养接种后在外植体切口处多酚氧化酶会产生褐化作用。通常认为硝酸银会对愈伤组织的褐化现象产生抑制作_}i;J,所以向可产生再生植株的沿阶草外植体的最适诱导培养基中添加lOmg/L浓度的AgN03观察添加硝酸银对愈伤产生及褐化的影响。11 中国农业太学硕I:论文 第三章结果与分析第三章结果与分析3.1外植体的选取时间和要求为了减少外植体过度分化给组织培养脱分化的抑制影响,通常选择幼嫩的外植体作为培养材料,冈此植物不同的外植体选取时间也有所不同。外植体嫩基的选取时间是2005年4月5日,选草坪中健康的返青沿阶革植株,切去部分老根。留取包裹有嫩叶及部分根的嫩基,并j_}l毛刷刷洗根部,州自来水冲洗干净。外植体根状辈芽点的选取时间是2005年4月15日。选草坪中生跃旺盛的沿阶草植株,_I}j自来水冲洗干净后。切取节问有芽点、疑度约为1.0cm的根状茎作接种材料。外植体块根和根尖的选取时问是2005年5月7日。选草坪中健康的沿阶草植株连根挖起,剪取幼嫩的根尖,长度约lcm;另将止常生艮的块根切成约3mm的薄片作为接种材料。花蕾{I J花柄的选取时间是2005年8月23日,于草坪中选沿阶草火而整齐的花序,,q-J白米水冲洗干净后,切取整个花蕾和长度约0.5cm的花柄作接种材料。叶片是通过浆果培养的无菌苗获得的。2005年9月30日,将沿阶草成熟浆果放到无激素添加的MS培养基中进行无菌茸培养。出苗后在苗的中上部剪取叶片约lem作为培养材料。3.2外植体的灭菌条件将外植体从沿阶草植株上切取后立即用自来水冲洗干净,按实验设计的54个处理给外植体消毒。先J_fj 70%的酒精消毒,消毒时间分别是20s、30s和40s,然后用无菌水冲洗1次后,马上放到净工作台中用NaCl03浸泡,NaCl03浓度分别是0.5%、1.O%和3.5%:消毒时间分别是15rain、20min、35min、40min、45min和55rain;虽后无菌水洗涤5次后立即接种到无激素添加的MS基础培养基中。经过15d培养观察,选出了各种外植体灭菌率为100%的最小消毒浓度和时间的组合(见表4)。11 中国农业人学硕1:论文 第三章结果与分析裹4沿阶草外檀体■佳消毒条件Table 4 Thc op6mal condition ofdisinfection of Oph/o删on bodin扫n外植体酒精消毒时间(s) Naa03浓度(%)№a仉消毒时问(vain)SegmentAlcohol disinfection time NaCl0,concentrationNa003 disin把c:tion time根状茎芽点bud of rootstock 30花蕾flower bud 40花柄日ower stalk叶JIleaf块根toot block根尖roottip嫩摹tenderbase303.51130 0.530 O.530 3.54010353.3外植体组织培养的结果3.3.1根状茎芽点根状孳芽点在组合1培养基中的诱导愈伤产生效果的处理如表5所示。T】0(N02,耽0)处理(MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.2mg/L)诱导根状茎芽点产生愈伤组织培养的效果最好,愈伤诱导率为97%,16d以后开始出现淡绿透明的愈伤组织,长势快。12 中国农业大学硕二L论文 第三章结果与分析II裹5组合1培养基对沿阶革根状茎意伤组织诱导的影响Table5 Effectofthe unitl mediumsoninducementofcallustissueofbudofo嘶iol,ogon:mfinieri将能够诱导根状茎芽点产生愈伤组织的培养基组合1的激素配比细化,进一步进行培养,找出最佳的诱导培养基条件。细化的激素组台4见表6。裹6组合4培养基对沿阶草根状茎生长和分化诱导的影响Table6 Effect oftheunit4mediumsongrowlh and differentiation ofbudof印h咖gonbodinien注:NAA(Naphthaleneacefic acid的缩写):萘乙醇:N:NAA的简写:6-BA(6-Benzyladeuine的缩写):6-苄基腺嘌峙;B:6-BA的简写组合4培养基对沿阶草根状茎芽点不定芽和生长、分化的诱导效果见表7。其中G22(MS+6.BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L)处理诱导根状茎芽点产生不定芽产生的效果虽好,不定芽诱导率是97%,16d以后开始出现淡绿透明的愈伤组织,长势快;25d后将愈伤组织切成约10mm3的小块转接到分化培养基中,35d后开始分化出不定芽,每个愈伤小块产生3-6个不定芽;不定芽长到约4cm时,将单株接种于生根培养基,经过约3周产生均明显的根。处理29、16、28、15的培养效果依次差之,处理35、23、9、34、27、17、50、21、10、加的培养效果依次更差。实验结果还表明:根状茎芽点生根培养基1/2MS+NAA0.1toga.较1/2MS+IBA0+25mg/L生成更粗的根和更多的根毛;蔗糖浓度3%,用0.8%琼脂固化的培养基比蔗糖浓度2%,用0.5%琼脂固化的培养基对根状茎芽点有更好的培养效果。 中国农业大学硕j:论文第三章结果与分析囊7组合4培养基对沿阶草撮状茎不定芽诱导和生长殛分化的影响Table7Effectofunit4mediumongrowth and diffvrentiationofbudsofoph缸poSon boa%诒r/另将沿阶草根状茎芽点诱导愈伤组织的组合4培养基中G22(N 20,B2 0)处理的6.BA部分或全部被KT替代:NAA被IBA替代比较培养效果。这一设计的激素组合5见表8。囊8诱导沿阶草撮状茎芽点分化的激素组合5Table8 Unit 50fhormonesforinducementofdiffcrenliationofbudof rootsloek of印船卿帅6DJhnNAA 0.20Z1(No.z,B2.o) Zz(N0。,B1 o,Kl o)Z3j(No z,Kio)!坠 Q:垫 自出2,如al注:NAP,(Naphthalcncacetic add的缩写):萘乙酸;6-BA(6-Benzyladenille的缩写)五-苄基腺嘌峙;KT(Kinetin的缩写l:激动索mA0adolc3一butyric acid的编写):吲哚3-丁酸 N:NAA的简写;B:6-BA的简写;K:KT的简写:I:IBA的简写从组合5的培养结果(见表9)可以得出,生长素IBA不能替代生长素NAA的作用,而细胞分裂素KT只能是部分而不是全部替代6-BA的作用。14 中国农业大学颁I:论文 第三章结果与分析表9组台s对沿阶蕈根状茎不定芽诱导和生长及分化的影响Table9 Effectofunit 5 mediumsongfowth anddifferentiationofbudsof rootstockofq撕蛔吗咿bodmieri由以上根状辈组织培养的效果可以分析得出,沿阶草根状苇组织培养效果最好的激素组合生长素NAA和细胞分裂素6-BA,最佳的培养基是6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L:其中NAA与6-BA的比例为1:10。产生作I}_Ij的生长素NAA浓度范围是0.1--0.35 mg/L;细胞分裂素6-BA浓度范嗣是1.52.5 meCL;前者与后者的比例范围是1/6~1/20。3.3,2花蕾花蕾在组合1培养基中的培养效果如表10所示。培养基MS+6.BAl.0mg/L+NAA0.6rag/L(120处理)对花蕾的培养效果最好,不定芽诱导率是98%。30d左右开始出现透明疏密适中的愈伤组织,愈伤组织K势快,渐绿;45d后愈伤组织切成约10mln3的小块转接到分化培养基中,15d厉分化山不定芽,数量多,产生5-8个不定芽;将单株接种于生根培养基,培养基1/2MS+NAA0.1mg/L未能将不定芽培养出根,而经过1/2MS+IBA0.25mg/L培养的花蕾不定芽约21d产生根和根毛。T27帆8,Bl 5)、T33(N1 oBl小T26(N08,Bl o)处理的培养效果依次差之。由花蕾在组合1培养基中的培养效果分析可得,花蕾中含有较高的内生细胞分裂素。较高浓度的细胞分裂素(1.5rag/L)和较低浓度的生长素r0.6rag/L)都不能使其产生愈伤组织.培养的效果主要取决丁两者的比例。NAA雨I 6-BA激素组合的比例范嗣是1/2~1,最适合的比例是3:5。实验结果还表明:蔗糖浓度2%,用0.5%琼脂固化的培养基比蔗糖浓度3%,用0.8%琼脂固化的培养基对花蕾有更好的培养效果。表10不同培养基对沿阶草花■不定芽诱导和生长覆分化的影响Tablel0 Effect ofthe differentmediumongrowth and differentiationofflowerbud ofOphiopogon 60dlnien处理Treat诱导率(%)生长分化情况Induction frequency Grown and differentiationT2“No.s,Bl o)12“No 8,B1 5)T33(N1mBl 5)80756060d dI现愈伤纽织,约90d开始不定芽形成,芽较多约40d出现愈伤组织,K势好,约60d不定芽形成,芽较多约75d出现愈伤组织,无不定芽产生 中国农业大学硕J!论文第三章结果』分析313.3花柄组合1培养基中有2处理可咀诱导花柄愈伤组织的产生。其中培养基为MS+6-BAl.5mg/L+NAA0。4rag/L的T15处理的培养效果最好,28 d开始出现愈伤组织,愈伤组织&势较快、质量较好:T8(Nn2,B,m)处理也可以诱导花柄产生愈伤组织。表5不同培养基对沿阶草花辆不定芽诱导和生长、分化的影响Table5 Effectofthe differen!medium ongrowth anddifferentiationofflower stalkofOphiopogon bod/n,.iri处理诱导率(%)Treat Induction frequency生长分化情况Crrowll and d眦rcntiationLTlj4995约75d f}:现愈伤组织,pq个月后不定芽形成,芽很少,无根产生28d{现愈伤纰织,透明浅绿.松紧适中,49d不定芽形成,芽多根据组合1对花柄的培养效果,细化培养基的激素处理,见组合6(表11),从中选择最佳的诱导花柄愈伤及分化组织产生的培养基。襄1l诱导沿阶草花柄愈伤组织的激素组合6Tablell Unit 60fhofmolw.$forinducementofcallustiSSueofflower stalkofOphurpogon bod/nieriCytokininNAA NAA NAA NAA NAANAA NAAconcentration(mg/nO.1 0.2 0.3 0.4 0,5 0.6 0.86-BA 05Hi(B5,N1)H2(8s,N z)Ha(B 5,N3)84(Bj,N14) H5毋女ND H毹B.5N 6)H“B 5,N 8)6-BA 1.0HB(Bt,N1)H“B1,N 2)HldBl,N毋H11(B1,N 4)H12(BI,NdH13(BI,N6)H14(81,N B)6-BA1.5H15(B1知N1)H16(B1j,N 2)H17(8I自N3)H1s(8I 5,NOHl9(815,H6)Hzo(B1 s,N 6)H21(al 5,N8)6-BA 2,0HB2,N1)H“B2,N 2)H2(B2,Nj)H2s(B2,N.4)H2dB 2,N曲Hz7cB2,N6)Hzs(B2,N.8)6-BA 2.5Hz9(82j,N1)HB2 5,N 2)H,1(B擒N矗H32(]]2.5,N旬H33(B岱,M6)H(Bz5N 6)H35(B2.5,N8)注:NAANaphthalencacetic acid的缩写):萘己酸,N:NAA的简写;6-BA(6-Benzyladeniae的缩写):6_苄基腺嘌呤,B:6-BA的简写培养基组合6对花柄培养效果见表12。培养基为MS+6-BAl.5mg/L+NAA0.4mg/L的H。“B1 5,N。)处理培养效果最好,28d左右开始出现愈伤组织,长势快、质量较好:40d后将愈伤组织切成约10ram3的小块转接到分化培养基中,49d开始分化出不定芽,产生约35个不定芽,60d不定芽诱导率是95%;不定芽4cm左右时,将单株接种于生根培养基,培养基1/2MS+NAA0,lmg/L未能将花柄不定芽培养出根,而经过1/2MS+IBA0.25mg/L培养的花柄不定芽经过约21d的培养可以看到根的生成。其中,处理H26(B 2,N6)、Hlo(B1N 3)、H25(B2,N 4)、H“B2,N 6)、H.7(Bl&N3)、H9(B1,N 2)的组织培养效果依次差之。16 裹12组合6培养基对沿阶草花柄不定芽诱导和生长及分化的影响Tablel2 Effectofunit6medium ongrowth anddifferentiationofflower stalkof聊姆叼帆60d班白n从表1l中分析可得,花柄组织培养效果主要取决于细胞分裂素和生K素的比例,NAA和6-BA激素组合的比例范同是2/10~3/10,撮适合比例是4:15.另外,备激素的浓度也有要求,细胞分裂素浓度范曝是1.o-2.0mg/L;对生长素的要求是0.2-0.6mg,L。3.3.4叶片、块根、根尖和嫩基根。沿阶草外植体叶片、块根、根尖和嫩基在所有组合的培养基中均未产生愈伤组织、不定芽和3.4组培苗的移栽效果将试验获得的沿阶草根状茎芽点、花蕾和花柄组织培养产生的生根苗经过2个星期的炼出后移栽至蛭石:草炭十:园士=1:1:1的基质盘中配合适当光照种植培养可以观察到3种外植体再生植株均能正常移栽;其中,花蕾产生的再生植株移栽效果晟好:根状茎芽点的较好;而花柄的最差,但仍能成活。3.5硝酸银(AgNOa)对愈伤产生和褐化的影响为了防lt养分不足和褐化影响,本试验不同阶段培养基均采用25天继代一次。在没有添加AgN03的情况下均较少产生褐化现象。当分别向沿阶草根状茎芽点、花蕾和花柄的最适诱导培养基中添加10mg/L浓度的AgN03时观察到硝酸银一定程度地抑制了愈伤的产生,却没有明显地抑制褐化现象的产生。17 中国农业人学碗士论文第四章 讨论与结论第四章讨论与结论4.1讨论4.1.1激素浓度对沿阶草组织培养效果的影响在植物的组织培养中,生长素主要被用做诱导刺激细胞分裂和根的分化,而使用细胞分裂素的主要目的是刺激细胞分裂,诱导芽的分化.叶片和茎长高,抑制根的生K。细胞分裂素常常与生长素配合,用以调节细胞分裂、细胞伸长、细胞分化雨i器官形成。我们由以上沿阶草根状茎芽点、花蕾和花柄愈伤组织培养的效果可以分析得出,培养的效果与激素浓度有很大关系。如对根状革芽点产生作用的生K素NAA浓度范嗣是0.1-0.35 mg/L,细胞分裂素6-BA浓度范同是1.5.2.5mg/L,而莫肖蓉等(2000)报导的金边阔叶山麦冬根状茎芽点诱导培养基是MS+6.BAI.5mg/L+NAA0+5mg/L,说明不同属间植物内源激素或诱导产生再生体系的激素需求有所不同;对花蕾来说较高浓度的细胞分裂素(1.5mg/L)莆I较低浓度的生长素(0.6rag/L)都不能使其产生愈伤组织,而莫肖蓉等(2000)的试验报导金边阔01山娄冬花蕾在诱导培养基MS+6.BAl.5mg/L+NAA0.5mg/L时仍可诱导60%的不定芽产生,这同样也说明不同属间植物内源激素或诱导产生再生体系的激素需求有所不同;花柄对激素的要求是细胞分裂素浓度范围1.0.2.0mg/L,生K素0.2-0.6mg/L。可见,植物的不同部位组织培养时对激素的要求不同,这除了与植物不同部位分化程度不同有关,也可能与不同外植体内源激素水平不同有很大的关系。4.1.2激素比例对沿阶草组织培养效果的影响从沿阶草根状茎芽点、花蕾和花柄愈伤组织培养的效果还可以分析得出,培养的效果与激素比例也有很大关系。如最佳的根状茎芽点培养基激素NAA与6-BA的比例为1:10,前者与厉者的比例范围是1/6~1/20;花蕾的最佳培养比例是3:5,范围是1/2~1;而花柄培养的最适合比例是4:15,范围是2/10~3/10。由此看到诱导细胞分裂由生长素与细胞分裂素浓度相关,同时对它们之间的比例也有较为严格的要求。4.1.3不同生根培养基的培养效果由以上实验对沿阶草生根培养基的研究可以看出,生艮素NAA和IBA对诱导沿阶草生根有不同的作用效果。NAA对根状茎芽点的生根培养效果比IBA好:而IBA对花蕾和花柄的生根培养有效果要,而NAA却不能诱导其根的形成。因此说,虽然生K素可以用米诱导根的分化,但植物对诱导根形成的生长索种类也是有所5&制的,并不是任何一种生长素都可以诱导根的形成。 4.1.4与几种植物组织培养效果的比较山麦冬、麦冬和沿阶草的药用价值很相似,也都是主要阻块根作为药用。将儿种植物的组织培养研究进行比较,期望可以得到一些有意义的结论。本次试验特意将已经报道的这3种植物组织培养适合的外植体及相应的最佳培养基用于沿阶草的组织培养中进行培养效果的比较。在比较之前,先看一F这3种植物在分类学上的关系:山麦冬属和沿阶草属在植物分类中是百合科相邻的两个属,其中山麦冬是山麦冬属的一个种.麦冬和沿阶革分别是沿阶草属的两个种。试验结果表明,诱导培养基MS+2,4.D8mg/L+NAA4mg/L+IAA4mg/L(杨乃尊,1992)、MS+2.4.D4mg/L+NAA2mg/Ln-IAA2mg/L(吴美芬,1988)和MS+6-BAl.0mg/L+NAA0.25mg/t,(张治国.1988)均来使得沿阶草叶片组织培养中获得增殖材料;山麦冬嫩基最佳诱导培养基MS+IBA2.0mg/L+NAA0.2meCL(林美爱等,2004)和苇尖摄佳培养基MS+BAl.08mg/L+KT1.0rag/L+IBA0.5medL(别运清,1994)在沿阶革的嫩基组织培养中也未得lⅡ增殖材料;莫肖蓉等(2000)报导的金边阔叶山麦冬根状茎芽点诱导培养基是MS+6-BAl.5mg,L+NAA0.5mg/L,所含细胞分裂素与生K素比为3:I,而适于沿阶草根状茎芽点增殖的培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L,所含细胞分裂素与生长素比为lO:1:适于沿阶草花蕾增殖的培养基生疑素与细胞分裂紊比例范围是为lf2~1,而莫肖蓉等(2000)报导的金边阔叶山麦冬花...

  内容提示:Y 938931分类号:密级:飞哦差≮夭等硕士学位论文单位代码:10019学 号:s030402沿阶草组织培养及再生体系的研究Study OH the system oftissue culture andregenerationof Ophiopogon bodinieri研 究 生:衄 拖指 导 教 师:屈 丞申请学位门类级别:盘坐题±专 业 名称:堇些科堂研 究 方向:越直堇鲤生缦他所 在 学 院;麴堑型拉堂跪2006年6月 摘 要用沿阶草的根状茎芽点、花蕾、花柄、嫩基、叶片、块根和根尖作为外植体,用MS作为基础培养基,在愈伤诱导、分化和生根过程中添加不同浓度和比例的细胞分裂素(6.BA,KT)和生艮素(NhA,IAA,IBA,2,4.D),培养结果及主要结论如卜:(1)根状茎...

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